FlowJo是一款專業(yè)的流式細胞分析專業(yè)軟件，F(xiàn)lowJo能兼容幾乎所有流式儀器采集的數(shù)據(jù)，通過圖像分析細胞的各種變化。FlowJo簡單易用，功能強大，真實的模擬數(shù)據(jù)支持，采用色彩豐富的二維圖進行系統(tǒng)分析，幫助用戶輕松了解了解細胞的狀態(tài)變化擁有流動室和液流驅動系統(tǒng)，光電轉換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等先進的科學技術。

FlowJo功能

1.單標樣本

單標記樣本數(shù)據(jù)常用的顯示方式是單參數(shù)直方圖。通常橫坐標可以是線性標度或對數(shù)標度，代表著所檢測的熒光或散射光的強度；縱坐標表示的是橫坐標某一特定熒光強度的細胞數(shù)，有時也用相對百分比來表現(xiàn)。

以3 color comp 文件夾中的CyPE comp.fcs進行分析演示。將此文件夾移至桌面，并把該數(shù)據(jù)文件夾從桌面拖入Flowjo中的組空間中。

在組空間中單擊選中“3 color comp”組，此時在樣本空間里顯示“3 color comp”組中的所有樣本。而后在樣本空間中雙擊“Cy5PE comp.fcs”，出現(xiàn)圖形窗口。

此為二維點圖，X軸選擇SSC（側向散射，細胞內(nèi)顆粒結構越復雜，質(zhì)量越大，SSC越大，反之越小。）Y軸選擇FSC（前向散射，細胞越大，F(xiàn)SC越大；反之越小。）

選擇設門工具（矩形門、橢圓門、多邊形門、自動門）中的任意一個，在二維點圖中選中淋巴細胞。

在圖形窗口中雙擊選中的淋巴細胞，生成新的圖形窗口。在X軸選擇Cy5PE:CD4，Y軸選擇Histogram，選擇設門工具（區(qū)域門、雙分門）中任意一個，在單參數(shù)直方圖中設門。

2.多色標樣本

多色標記樣本，包含雙標記、三標記及以上的樣本。橫坐標和縱坐標分別代表與細胞有關的兩個獨立參數(shù)，平面上的每一個點表示具有相應坐標值的細胞。

以三標記樣本為例，選擇3-color-experiment文件夾中的931115-B02-Sample01.FCS進行分析演示。同樣，在在樣本空間中雙擊“931115-B02-Sample01.FCS”樣本，出現(xiàn)圖形窗口，顯示為二維點圖。X軸選擇FSC，Y軸選擇SSC。然后選擇多邊形設門工具，在二維點圖中選中淋巴細胞。

雙擊淋巴細胞門，出現(xiàn)圖形窗口，X軸選擇Fluor::CD3，Y軸選擇FSC。使用矩形設門工具選中CD3陽性細胞，設門并命名為T細胞。

雙擊T細胞門，出現(xiàn)圖形窗口，在X軸選擇Cy5PE::CD4，Y軸選擇PhyEry::CD8，使用十字門工具設門（拖動鼠標將四分門移到目標位置即可，一般根據(jù)細胞分群的趨勢，四分門的界定線可設在陰性、陽性細胞的分群處），如下圖所示：

Q1：CD8單陽性細胞，為CD8+ T細胞

Q2：雙陽性細胞

Q3：CD4單陽性細胞，為CD4+ T細胞

Q4：雙陰性細胞

3.細胞凋亡（Cell apoptosis）

拖入凋亡樣本，雙擊原始數(shù)據(jù)打開圖形窗口。X軸選擇FSC-A，Y軸選擇SSC-A。分析凋亡的細胞選擇上圖所示的細胞群體進行分析。細胞碎片不予分析。

在SSC/FSC圖中雙擊“分析的細胞群體”，X軸選擇FITC,用來表示AnnexinV-FITC。Y軸選擇PE-Texas,用來表示PI。用四分門設門工具界定活細胞和凋亡細胞。如下圖所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。

Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。

Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。

通常統(tǒng)計細胞凋亡率時采用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV陽性群）。

4.細胞周期（Cell Cycle）

細胞周期的檢測是流式細胞儀最為廣泛的應用之一。細胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細胞從親代分裂結束到子細胞分裂結束所經(jīng)歷的過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準備，在S期完成染色體DNA的復制，在G2期進行必要的檢查和修復，以保證DNA復制的準確性。在M期完成遺傳到子細胞中的均等分配，使細胞進行分裂。

細胞周期檢測中PI最為常用。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

以cell cycle 文件夾中的5206.001，PI標記為例，設門選取目標細胞群體，將細胞碎片排除在外。即雙擊工作臺中的5206.001樣本，打開圖形窗口。X軸選擇FSC-H，Y軸選擇SSC-H，細胞碎片位于左下角的位置，設門選中目標細胞，如下圖：

設門選中要進行細胞周期分析的單細胞群體，排除粘連細胞（粘連在一起的雙細胞或多細胞團塊等）的影響。X軸選擇FL2-W(width)，Y軸選擇FL2-A(area)，設門方式如下圖：

BD的流式儀采集的數(shù)據(jù)：在進行周期分析的時候，通常是采用FL2-A與FL2-W（或者FL2-A與FL2H）進行設門。

Beckman的流式儀采集的數(shù)據(jù)：X軸選擇FL3-LIN,用來表示PI的線性信號。Y軸選擇FL3-PEAK,用來表示PI的峰值信號。設門方式如下圖：

在FlowJo工作臺中選中“單細胞群體”這個節(jié)點，在菜單欄的“工具”中選擇“細胞周期”，打開周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期細胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等數(shù)據(jù)。

圖中粉色的曲線是周期擬合的模型曲線，黑色的為樣本曲線。理想狀況是粉色和黑色曲線吻合一致為最佳。擬合的好壞可以根據(jù)右邊的RMS值來判斷。RMS(root mean square error)值越小越好，當周期擬合的不好的時候，可以通過更換擬合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或者更改限制條件確保（G1是G2的兩倍）進行調(diào)整。

而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期細胞所占的百分比。G1/G2均數(shù)：G1/G2期細胞熒光強度的平均數(shù)。CV（Coefficient of Variation，變異系數(shù)）：儀器因素和樣品制備及染色過程對標本的人為影響。通常G0/G1峰的CV來檢測分辨率或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的變異系數(shù)，其大小反映了G1/G2峰的寬度，數(shù)值越小，峰越窄。

FlowJo 處理流式數(shù)據(jù)簡單易學，而且TOP10 免疫學期刊上的文章大多數(shù)都是用 FlowJo 分析數(shù)據(jù)。使用好FlowJo對發(fā)高分文章會有很大的幫助。

安裝方法

首先安裝主程序 ，安裝完成后先不要打開。插上U盤，運行注冊機，自動識別到U盤，點擊下方【Generate license above device!】會自動在U盤中生成一個 license.key 文件。

運行軟件，選擇【Use a hardware-based license (dongle)】后點擊【Done】按鈕即可。



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